SUSTech科研说 | 外号“花菜杀手”，南科大博士生在结构生物学领域实现突破

近日，南科大博士生谢国辉以共同第一作者的身份，收获了人生中的第一篇顶级学术期刊Science的论文。这项研究解析了最后一种结构未知的真核RNA聚合酶——Pol V的功能机制，提出其通过滞留在染色质上而招募下游作用因子引起DNA甲基化和基因沉默的工作模型。审稿人在评价中指出，该研究为解析真核生物RNA聚合酶的分子结构找到了最后一块“拼图”。

研究成果以"Structure and mechanism of the plant RNA polymerase V"为题发表

“科研小白”找到最后一块拼图

2019年5月，谢国辉作为科研助理进入南科大生物系杜嘉木教授课题组，开始了结构生物学的研究。那时的他，对这个领域还是一知半解。他介绍自己之前只研究植物病理方面，对蛋白纯化和结构解析可以说完全是一个“小白”。“幸运的是我遇到了一群良师益友，杜嘉木老师给予了我最大的支持与指导，胡泓淼师兄和杜璇师姐带领我进入蛋白纯化与结构解析的大门。”

他所做的研究，与DNA甲基化相关。

植物在不同环境、生长的不同阶段都会对自身的基因进行表达调控，某些时候会把一些基因沉默掉，促进另外一些基因的表达，以此来适应它的生长环境。例如在旱灾的时候，植物会调控自身的某些基因应对干旱，减少自身水分的蒸发或者不再继续长高。DNA甲基化就是一种重要的基因表达调控方式，这是杜嘉木课题组研究的主要方向。植物中DNA甲基化需要一个非常特殊的RNA聚合酶，即Pol V的参与。与常规的RNA聚合酶合成RNA不同，Pol V不仅要合成RNA，还需要停留在染色质上为其他因子提供“定位”。

“所以大家一直很疑惑Pol V到底怎么发挥功能的？想要进行更细致的研究就需要开展Pol V的结构测定工作，这是我进课题组后导师交给我的第一个课题。”谢国辉介绍。

谢国辉（后排右二）与课题组成员合影

当时，导师让谢国辉与另一位一作胡泓淼博士一起摸索，去揭开Pol V结构上的面纱。谁承想，这一摸索就是三年多。期间，谢国辉转换了身份，于2021年攻读博士学位，手上的这项研究，分量也更加沉重。“在一次次失败、崩溃中，不断总结经验，靠着极其微量的样品外加想象，一点点地摸索出复合物的性质，最终成功达成电镜数据收集与结构解析。”谢国辉说。

2022年12月5日，谢国辉等人怀着忐忑的心情将稿件投出，很快便收到了审稿人的意见。而且，三位审稿人的意见都十分积极，并认为谢国辉等人的研究为解析真核生物RNA聚合酶的分子结构找到了最后一块“拼图”。

实验室里的“花菜杀手”

一将功成“万菜枯”。在这篇Science论文背后，不得不讲讲那些大量用于实验的花菜。打开手机订单页面，谢国辉好奇地数了一下这3年里到底用了多少花菜，结果让他大吃一惊：整整用了1.5吨花菜！

谢国辉在进行蛋白提纯实验前的准备

为什么当初选择花菜作为实验材料呢？谢国辉介绍，研究的Pol V在植物中含量极低，提纯难度大，给前期的研究带来了极大的挑战。“在一次学术交流中，中科院曹晓风院士提到可以使用花菜提纯蛋白，这给了我们极大的启发。”

提取花菜的蛋白，首先需要将花菜的花削下来，用液氮冷冻后研磨成粉，加入细胞核提取液中，再将细胞核提取出来，并进行蛋白复合物的提取纯化，但能纯化出来的Pol V微乎其微。“10公斤的花菜往往能提取60克的细胞核，再从这60克的细胞核中提取蛋白，最后提出来的蛋白也就3微克左右。”谢国辉表示。

更困难的是，很多时候拿到细胞核提取物再进行纯化后，根本鉴定不到蛋白质，“我们每一步都会检测，可以看到最开始是有Pol V蛋白的，然后随着不断地纯化，蛋白可能在某一步骤就突然不见了，这是令我们最头疼的时候，因为影响的因素有很多，需要逐个排查。”

实验所用的花菜

三年来，谢国辉和同伴重复了上百次蛋白提纯的实验过程。在前两年的时间里，谢国辉每隔一周就要切几十公斤的花菜，他将提取到的细胞核冻存在冰箱里，做实验时就从里面取一部分出来。为此，谢国辉还收获了有趣的外号：花菜杀手。

经历了两年多与花菜斗智斗勇的日子，谢国辉等人终于获得了一株可以顺利提取蛋白的抗体，摸索出了合适蛋白提取纯化条件，从而获得了足够的蛋白，但他们又面临着另外一个难题。“一开始我们觉得只要蛋白提取出来，接下来的实验会更容易。但真正拿到蛋白后，我们发现它与其他聚合酶的性质不太一样，蛋白一旦多了以后它就聚在一起了，根本就不适合电镜数据的收集，更别说解析结构了。”谢国辉说。

于是，谢国辉与正在深圳大学进行博士后工作的杜璇合作，在经过了近五个月的调试之后，终于将聚合的蛋白转变为独立的颗粒。“得益于前期的尝试，我们后期对蛋白的摸索还是比较有方向性。”

做科研要有内驱力

连续做十七八个小时的实验，对谢国辉来说是常态。从白天到黑夜，从凌晨到黄昏，他几乎见过了每一个时刻的南科大。事实上，做基础研究，在实验中常常会遇到难以克服的事。庆幸的是，谢国辉遇到了好的科研领路人——杜嘉木教授。“在实验设计与实验结果分析方面，杜老师给了我很多的帮助和指导。即使是实验进行不下去的时候，老师也没有给我太大的压力，而是鼓励我先放下课题，调整心态。”谢国辉说道。

在蛋白纯化最不顺利的那段日子里，大概有两周多的时间，谢国辉与胡泓淼都没有去做实验。那时候，他们相互鼓励，重新回看实验记录本、查漏补缺，不断进行探索，同时向导师和同学请教，终于熬过了那段迷茫的时间。

在谢国辉看来，他能以一作发表Science论文，除了有运气成分之外，更重要的是做科研一定要有内驱力。“做实验虽然会遇到很多失败的时候，但办法总比困难多，或许正是这股不甘于失败的驱动力，让我能够在漫漫科研路中坚持下来。”

谈及未来规划，谢国辉说道：“现在的成果使得我再一次坚定了科研信念，更加专注于眼前，希望能够在杜老师的引导下，继续在科研道路上前行，在相关领域取得更多成果。”

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素材来源：中国科学报

编辑：曾昱雯

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